SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)，也叫变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支撑介质的一种含有蛋白变性剂SDS（十二烷基硫酸钠）的常用电泳技术，常用于检测蛋白质。

  聚丙烯酰胺凝胶是由必定量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚组成的三维网状结构。SDS-PAGE一般都会选用不接连凝胶体系，即含有不同孔径的两层凝胶：上层胶（5%浓缩胶）和基层胶（别离胶），浓缩胶孔径较大，不同巨细的蛋白质分子泳动速率相同，较稀的样本经过浓缩胶的搬迁效果被浓缩至一个狭隘的区带，当进入小孔径的别离胶后，不同巨细蛋白质因为所带电荷不同，表现出不同的搬迁率，因为分子筛效应和电荷效应，使不同蛋白质在同一电场中能够有显着效果地的别离。

  蛋白样品电泳前，需与上样缓冲液（Loading Buffer）混合后煮沸处理，上样缓冲液中含有强还原剂（DTT或2-Me）和蛋白变性剂SDS，损坏了蛋白质的空间结构，将蛋白质解聚成多肽链，并将SDS包覆在肽链外表，SDS带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，使蛋白带有共同的负电荷（约2个氨基酸一个SDS）和共同的形状（棒状），消除了不同蛋白质之间的电荷差异和结构差异。因为SDS与蛋白质的结合是与分子量成份额的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的搬迁速度首要依据分子巨细。

  经过将不知道分子量蛋白和多种已知分子量蛋白一同电泳，比照其搬迁速度，推算出不知道蛋白的分子量近似值。多种已知分子量蛋白称为蛋白分子量规范，也叫蛋白Marker，市道上有制品出售，本试验选用多色预染Marker，也称彩虹Marker。

  1.试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、电泳级SDS、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺）、四甲基乙二胺（TEMED）、甲醇、过硫酸铵（AP）、考马斯亮蓝R250、冰乙酸、纯化水、6X Loading Buffer、10 kDa-180 kDa蛋白Maker；

  2.资料：烧杯、不锈钢盆、EP管、防爆夹、浮漂、加样枪及枪尖、量筒、吸量管、10mL离心管。

  3.仪器：FA2004N型电子天平、DYY-8C型电泳仪、DYY-BC型笔直电泳槽、制胶器、微波炉、电磁炉、纯水机。

  1．配液：依据用量，依照《附录：SDS-PAGE法检测分子量试剂配方》进行制造。

  笔直电泳槽的玻璃板整理洗刷洁净后，将凹型玻璃与平玻璃堆叠，将两块玻璃板放入电泳槽支架内（短玻璃朝里），并将电泳槽支架在桌面水平悄悄磕几下，使玻璃板底部对齐，然后刺进斜插板到适中程度，并将其固定在制胶器上，依照配方制造10%的别离胶10mL（2块胶），和4mL 5%的浓缩胶（2块胶），别离胶参加TEMED后当即混匀，敏捷沿凝胶腔的长玻璃板的内面慢慢滴入，当心不要发生气泡，给浓缩胶留出约2 cm的空间。在丙烯酰胺溶液上缓慢掩盖纯化水进行压实，避免空气分散到凝胶中按捺聚合效果，并确保凝胶外表水平。在室温条件下，凝胶应在30min左右聚合完结，聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率的改变。

  倒掉掩盖层纯化水，并用滤纸条吸净残留的水，留意勿损坏凝胶外表，浓缩胶中参加TEMED，混匀后敏捷加在别离胶上，并当即刺进洁净的加样梳，留意别混入气泡。约30min浓缩胶聚合后，拆下制胶器，放入电泳槽内，在两片玻璃板中心加注1×电泳缓冲液后当心移去梳子，避免损坏加样孔，加样梳取出后，必定要调查凝胶梳齿是否倾斜，如有倾斜，需要用注射器针头或许接种针将其摆正。最终再参加少数电泳缓冲液，使玻璃板内缓冲液呈满溢状况，外周电泳液深度约2-3 cm左右即可。

  将意图蛋白样品（约1mg/mL）于-20℃冰箱中取出，室温消融后混合均匀，取出25μL置于一新1.5mL EP管内，参加5μL 6X Loading Buffer，混合均匀，盖上管盖，并在管盖上标记好组别，用防爆夹夹住管口，刺进到浮漂孔内，100℃煮沸5- 15 min，本试验选用的蛋白Marker为预处理样本，不需要此煮样操作。

  电泳槽内加电泳缓冲液没过加样孔，倾斜整个设备以赶开凝胶下面或许留有的气泡，按预订次序加样，每孔参加20μL，在蛋白Marker孔中参加5μL蛋白Marker。

  加样完毕，盖好上盖，衔接电泳仪，翻开电泳仪开关后，设置恒压80V（电压调80V，电流调最大）20min，样品中的溴酚蓝指示剂压缩成一条直线且抵达别离胶后，调理恒压120V 约1h 40min（或200V 30-40min），当溴酚蓝指示剂搬迁到凝胶前沿时封闭电源中止电泳。从电泳设备上卸下玻璃板，用卡片剥下凝胶后切除一角以标示凝胶方位（或将Marker孔设置在前面）。

  将凝胶冲刷后浸泡在染色液中，置于摇床上37℃染色2h或许室温染色过夜（快速染色可用微波炉煮沸后静置10min，2-3次重复），染色液可回收重复使用。

  染色完毕后，将凝胶漂洗后浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间替换脱色液3次；或选用快速脱色，微波炉煮沸后静置15min，3-4次重复，每次均换新脱色液。直至蛋白条带明晰停止。

  将显现蛋白条带的凝胶摄影，选用凝胶呈像体系软件核算分子量和纯度，并张贴试验成果相片。

  3. 制胶时TEMED最终参加，参加后当即进行制胶，避免凝结太快导致制胶失利；

  4. 制胶时待胶凝结后再进行下一步操作，凝结时间一般为30min，但室温低时或许会延伸；

  5. 加样梳取出后，必定要调查凝胶梳齿是否倾斜，如有倾斜，需要用注射器针头或许接种针将其摆正；

  6. 制样时必定要用防爆夹夹牢EP管，避免煮沸过程中管盖爆开导致样品丢失；

  7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20寄存数月，可是重复冻融会使蛋白质降解；

  8.上样时，当心不要使样品溢出而污染相邻加样孔，蛋白Marker孔不要设置在中心，避免分不出凝胶正反面；

  2.30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1g，加纯化水定容至100mL。

  5.10%过硫酸铵（AP）：2g过硫酸钠，加纯化水定容至20mL，1mL/支分装，-20℃冻存。

  6.5×电泳缓冲液：15.1gTris碱，94g甘氨酸，5g电泳级SDS，加纯化水溶解后定容至1000mL，用前5倍稀释。

  7.考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R250 0.5g，参加甲醇 150mL，冰乙酸 50mL，研磨溶解，滤纸过滤后，加纯化水定容至500mL。

  脱色液：冰醋酸100mL，甲醇300mL，加纯化水定容至1000mL。回来搜狐，检查更加多